Durch das Untersuchungswasser lässt man für 2 bis 3 Minuten Sauerstoff oder Luft hindurchperlen (z. B. aus einer Druckgasflasche oder mit einer Aquariumpumpe) und füllt das sauerstoffgesättigte Wasser in die Winklerflaschen um (das Volumen dieser Flaschen muss genau bekannt sein, wenn sie restlos gefüllt sind bis an den Schliff).

Zwei der Winklerflaschen (W 1 und W 2) werden sofort luftblasenfrei verschlossen und dunkel an einem Ort mit möglichst gleichbleibender Temperatur (20°C) für 5 Tage (BSB₅) aufbewahrt. In die dritte Flasche (W 3) werden jeweils 1 mL Mangan(II)-chloridlösung und kaliumiodidhaltige Natronlauge einpipettiert. Die Flasche wird ebenfalls luftblasenfrei mit Untersuchungswasser gefüllt und gut geschüttelt. Die weitere Untersuchung erfolgt wie unter "Sauerstoffsättigung" beschrieben (auch für die Proben W 1 und W 2 nach 5 Tagen).